ИФА-Хлами-IgG-Tr

2.1  Состав набора:

2.2  Основные компоненты набора «ИФА-Хлами-IgG-Tr» – иммуносорбент и конъюгат (раствор конъюгата).

Иммуносорбент представляет собой разборный полистироловый планшет, в лунках которого сорбирован рекомбинантный антиген (С-концевой фрагмент основного белка наружной мембраны МОМР) Chlamydia trachomatis.

Конъюгат (раствор конъюгата) представляет собой моноклональные антитела мыши к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец – сыворотка крови человека, содержащая видоспецифические антитела класса G к Chlamydia trachomatis и не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и HВs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56 °С в течение 3 ч.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к Chlamydia trachomatis, ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С, Treponema pallidum и HВs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре           56 °С в течение 3 ч.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета образцов сыворотки (плазмы) инфицированной крови человека видоспецифические антитела к Chlamydia trachomatis связываются с антигеном Chlamydia trachomatis, сорбированном на поверхности лунок планшета иммуносорбента, образуя иммунные комплексы «антиген–антитело». Образовавшиеся комплексы выявляют при помощи иммуноферментного конъюгата. После отмывания несвязавшихся компонентов комплекс «антиген–антитело класса G–конъюгат» выявляют, добавляя в лунки планшета раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена (ТМБ). При этом в лунках, содержащих видоспецифические антитела к Chlamydia trachomatis, происходит изменение окраски раствора. В лунках, не содержащих видоспецифические антитела к Chlamydia trachomatis, изменение окраски раствора не произойдет.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты). Интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП), ОЕ, при длине волны          450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации видоспецифических антител, содержащихся в образце сыворотки (плазмы) крови человека. Чем выше содержание видоспецифических антител класса G к Chlamydia trachomatis в образце, тем выше интенсивность окрашивания раствора.

2.3  Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы.

Продолжительность анализа составляет 1 ч 15 мин.

4.1  Для исключения ложных результатов исследуемые образцы сыворотки (плазмы) крови человека необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сыворотки крови человека, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение                15 мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сыворотки крови человека можно хранить при температуре (2-8) °С не более 7 суток. Замороженные образцы (желательно до температуры минус 20 °С и ниже) можно хранить не более 12 месяцев. Допускается замораживание образца не более двух раз, поэтому следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов за счет оперативности проведения анализа.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

- не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

- для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

- всю используемую для приготовления реагентов посуду нельзя обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

- для работы с РХ и хромогеном ТМБ необходимо использовать отдельные емкости для растворов и наконечники для пипеток;

- необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

- время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

- при использовании промывателя необходимо следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

- необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

- дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

- для работы с образцами исследуемой сыворотки (плазмы) крови человека и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки (плазмы) крови человека, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником;

- при внесении в лунки раствора Кг в рабочем разведении (РК) нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета;

- во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

6.1  Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин.

Все образцы сыворотки (плазмы) крови человека и реагенты набора перед проведением анализа необходимо тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2  Приготовление раствора для промывания планшета

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка.

Для приготовления раствора для промывания планшета содержимое флакона с ФСБ-Т×25 необходимо разбавить в 25 раз водой очищенной. Для этого в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной (деионизированной) воды до метки 700 мл и аккуратно перемешать раствор, избегая образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица А.1 Приложения А) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной (деионизированной) воды и перемешать раствор.

Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3  Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Неиспользованные стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С не более 3 месяцев.

6.4  Подготовка К⁺, К^–, РР-С, РР-К,  БРС,  и стоп-реагента

Иммуносорбент, К⁺, К^–, РР-С, РР-К, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Внимание! Во флаконах с РР-С, РР-К  возможно выпадение осадка. Перед использованием содержимое флаконов тщательно перемешать, не допуская образования пены.

Неиспользованные РР-С, РР-К, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К⁺ и К^- после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5  Приготовление раствора Кг в рабочем разведении

Из флакона с Кг отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с РР-К. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К, добавить Кг в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг в рабочем разведении готовить непосредственно перед использованием! Раствор Кг в рабочем разведении можно хранить не более 15 мин при температуре (18-25) °С. Необходимо использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.6  Приготовление рабочего раствора субстрата

Если флакон с хромогеном ТМБ содержит кристаллы, его необходимо прогреть перед использованием в течение                 (3-5) мин при температуре (37±1) °С до полного растворения кристаллов.

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона осторожно перемешать.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромоген ТМБ в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и осторожно перемешать раствор.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовить непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить не более 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Необходимо использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники.

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

8.1 Промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) один раз. Для этого необходимо внести во все лунки по (0,30-0,35) мл раствора, а затем удалить содержимое лунок иммуносорбента в емкость с дезраствором. По окончании промывания тщательно удалить остатки жидкости из лунок, постукивая планшетом иммуносорбента в перевернутом положении (лунками вниз) по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена.

8.2  В лунки иммуносорбента внести контрольные образцы. Схема внесения контрольных образцов в лунки иммуносорбента при постановке анализа:

а) при постановке ИФА на полном планшете иммуносорбента или на двух и более стрипах: в любые две лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) К⁺, в три другие лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) К^–, в одну лунку иммуносорбента внести 0,1 мл (100 мкл) РР-С для контроля конъюгата (ККг);

б) при постановке ИФА на одном стрипе в любую одну лунку иммуносорбента внести 0,1 мл (100 мкл) К⁺, в две другие лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) К^–, в одну лунку иммуносорбента внести 0,1 мл (100 мкл) РР-С для контроля конъюгата (ККг);

8.3  В остальные лунки иммуносорбента внести по 0,06 мл (60 мкл) РР-С, затем внести по 0,04 мл (40 мкл) образцов исследуемой сыворотки (плазмы) крови человека. Раствор в каждой лунке перемешать пять раз пипетированием, при этом во время пипетирования цвет РР-С должен измениться!

Внимание! Общее время внесения в лунки иммуносорбента контрольных и исследуемых образцов не должно превышать (5-10) мин! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

8.4  Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.

8.5  Удалить содержимое лунок иммуносорбента с помощью промывателя, затем промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) пять раз.

8.6  Во все лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) раствора Кг в рабочем разведении (п 6.5) . Раствор Кг в рабочем разведении перед внесением в лунки иммуносорбента перелить из флакона в прилагаемую к набору пластиковую ванночку.

Внимание! Раствор Кг в рабочем разведении необходимо вносить в лунки иммуносорбента с использованием одноразовых наконечников, прилагаемых к набору!

8.7  Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.

8.8  Удалить содержимое лунок иммуносорбента с помощью промывателя, затем промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) пять раз.

8.9  Во все лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.6) . Рабочий раствор субстрата  перед внесением в лунки иммуносорбента перелить из флакона в прилагаемую к набору пластиковую ванночку. При приготовлении рабочего раствора субстрата (п.6.6) флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37±1)° С до полного растворения кристаллов.

Внимание! Рабочий раствор субстрата необходимо вносить в лунки иммуносорбента с использованием одноразовых наконечников, прилагаемых к набору!

8.10  Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать при температуре (37±1) °С в защищенном от света месте в течение 15 мин.

Внимание! По окончании инкубации в лунках иммуносорбента с образцами сывороток, содержащими видоспецифические антитела класса G к Chlamydia trachomatis, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации антител: от бесцветной до голубой.

8.11  Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки иммуносорбента по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента.

Внимание! В лунках иммуносорбента с образцами сывороток, содержащими видоспецифические антитела класса G к Chlamydia trachomatis, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации антител с голубой (синей) на желтую.

8.12 Не позже чем через (1-2) мин после остановки реакции определить значения ОП, ОЕ, в лунках иммуносорбента в одноволновом режиме при длине волны 450 нм.

10.1  Набор поставляется в двух вариантах комплектации:

1  комплект 1 – для проведения анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

2  комплект 2 – для проведения анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы.

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

СП ООО «Фармлэнд» Почтовый адрес:220113 г. Минск, ул. Восточная, 129. Тел\факс (017) 2621417.

По вопросам применения и качества набора обращаться на предприятие-изготовитель СП ООО «Фармлэнд».