ИФА-ВПГ-I/II IgМ

Вы здесь

ИФА-ВПГ-I/II IgМ

Торговое наименование: 
ИФА-ВПГ-I/II IgМ
Международное наименование: 
ИФА-ВПГ-I/II IgМ
Категория: ИФА тест-системы
Назначение: Для диагностики TORCH-инфекций

Описание

1  Назначение набора

1.1  Набор предназначен для выявления антител класса М к вирусу простого герпеса первого и второго типов (ВПГ-I/II) в сыворотке или плазме крови человека “in vitro” методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

 

2  Характеристика и принцип работы набора

2.1  Состав набора:

Наименование компонента

Количество

Иммуносорбент

1 планшет

Положительный контрольный образец (К+)

1 флакон, 1,5 мл

Отрицательный контрольный образец (К)

1 флакон, 3,0 мл

Конъюгат (Кг)

1 флакон, 0,5 мл

Раствор для предварительного разведения сывороток (РПР-С)

1 флакон, 11,0 мл

Раствор для разведения сывороток (РР-С)

1 флакон, 11,0 мл

Раствор для разведения конъюгата (РР-К)

1 флакон, 13,0 мл

Буферный раствор для субстрата (БРС)

1 флакон, 13,0 мл

Хромоген ТМБ

1 флакон, 0,5 мл

25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25)

1 флакон, 28,0 мл

Стоп-реагент

1 флакон, 6,0 мл

Планшет для предварительного разведения сывороток

1 штука

Комплект ванночек для реагентов с наконечниками для многоканальных пипеток

1 комплект

Клейкая пленка

3 штуки

 

2.2  Основные компоненты набора «ИФА-ВПГ-I/II IgМ» – иммуносорбент и конъюгат (раствор конъюгата).

Иммуносорбент представляет собой разборный полистироловый планшет, в лунках которого сорбирована смесь рекомбинантных антигенов ВПГ-I/II.

Конъюгат представляет собой моноклональные антитела мыши к IgМ человека, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец – сыворотка крови человека, содержащая антитела класса М к ВПГ-I/II и не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и HВs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56 °С в течение 3 ч.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВПГ-I/II, ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С, Treponema pallidum и HВs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56 °С в течение 3 ч.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета иммуносорбента образцов сыворотки (плазмы) инфицированной крови человека специфические антитела к ВПГ-I/II связываются с антигенами ВПГ-I/II, сорбированными на поверхности лунок планшета иммуносорбента, образуя иммунные комплексы «антиген–антитело». Если в исследуемом образце присутствуют антитела ревматоидного фактора класса М, они связываются РФ-абсорбентом, входящим в состав РР-С, и при отмывке удаляются из реакционной смеси вместе с избытком антител класса G. Образовавшиеся комплексы                          «антиген–антитело» выявляют при помощи иммуноферментного конъюгата. После отмывания несвязавшихся компонентов комплекс «антиген–антитело класса М–конъюгат» выявляют, добавляя в лунки планшета раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена (ТМБ). При этом в лунках, содержащих специфические антитела класса М к ВПГ-I/II, происходит изменение окраски раствора. В лунках, не содержащих специфические антитела класса М к ВПГ-I/II, изменение окраски раствора не произойдет.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты). Интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП), ОЕ, при длине волны   450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации специфических антител, содержащихся в образце сыворотки (плазмы) крови человека. Чем выше содержание антител класса М к ВПГ-I/II в образце, тем выше интенсивность окрашивания раствора.

2.3  Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы.

Продолжительность анализа составляет 1 ч 45 мин.

 

 

3  Меры предосторожности при работе с набором

3.1  Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

- работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

- работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями [1], [2], и [3].

3.2  Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.

3.3  При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4  Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями [4].

3.5  Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями [5].

 

4  Правила работы с набором

4.1  Для исключения ложных результатов исследуемые образцы сыворотки (плазмы) крови человека необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сыворотки крови человека, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение                15 мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сыворотки крови человека можно хранить при температуре (2-8) °С не более 7 суток. Замороженные образцы (желательно до температуры минус 20 °С и ниже) можно хранить не более 12 месяцев. Допускается замораживание образца не более двух раз, поэтому следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов за счет оперативности проведения анализа.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

- не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

- для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

- всю используемую для приготовления реагентов посуду нельзя обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

- для работы с РХ и хромогеном ТМБ необходимо использовать отдельные емкости для растворов и наконечники для пипеток;

- необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

- время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

- при использовании промывателя необходимо следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

- необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

- дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

- для работы с образцами исследуемой сыворотки (плазмы) крови человека и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки (плазмы) крови человека, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником;

- при внесении в лунки раствора Кг в рабочем разведении  нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета;

- во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

 

5  Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1  Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны от 450 нм до 700 нм;

- полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

- суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;

- пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,01 до 5,0 мл;

- пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;

- мерный цилиндр вместимостью 1000 мл;

- флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

- ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

- вата медицинская гигроскопическая;

- бумага фильтровальная;

- перчатки резиновые хирургические;

- раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;

- раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

- вода деионизированная или дистиллированная;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива жидких отходов.

 

6  Подготовка к проведению анализа

6.1  Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин.

Все образцы сыворотки (плазмы) крови человека и реагенты набора перед проведением анализа необходимо тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2  Приготовление раствора для промывания планшета

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка.

Для приготовления раствора для промывания планшета содержимое флакона с ФСБ-Т×25 необходимо разбавить в 25 раз водой очищенной. Для этого в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной (деионизированной) воды до метки 700 мл и аккуратно перемешать раствор, избегая образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица А.1 Приложения А) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной (деионизированной) воды и перемешать раствор.

Раствор для промывания планшета можно хранить при температуре (2-8) °С не более 7 сут.

Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3  Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Неиспользованные стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С не более 3 месяцев.

6.4  Подготовка К+, К, РПР-С, РР-С, РР-К,  БРС и стоп-реагента

Иммуносорбент, К+, К, РПР-С, РР-С, РР-К, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Неиспользованные РПР-С, РР-С, РР-К,  БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К+ и К- после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5  Подготовка исследуемых образцов

Перед проведением анализа каждый образец сыворотки (плазмы) крови человека развести РПР-С в 10 раз. Для этого в лунки планшета для предварительного разведения сывороток или в полистирольные пробирки внести по 0,09 мл (90 мкл) РПР-С и по 0,01 мл (10 мкл) исследуемых образцов. Перемешать полученные растворы 5 раз пипетированием, при этом цвет РПР-С в каждой лунке должен измениться.

Разведенные исследуемые образцы сыворотки (плазмы) крови человека можно хранить не более 2 ч при температуре   (18-25) °С.

6.6  Приготовление раствора Кг в рабочем разведении

Из флакона с Кг отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с РР-К. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К, добавить Кг в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг в рабочем разведении готовить непосредственно перед использованием! Раствор Кг в рабочем разведении можно хранить не более 15 мин при температуре (18-25) °С. Необходимо использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.7  Приготовление рабочего раствора субстрата

Если флакон с хромогеном ТМБ содержит кристаллы, его необходимо прогреть перед использованием в течение                   (3-5) мин при температуре (37±1) °С до полного растворения кристаллов.

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона осторожно перемешать.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромоген ТМБ в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и осторожно перемешать раствор.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовить непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить не более 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Необходимо использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники.

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

 

7   Требования к промыванию планшета

7.1  Для промывания планшета рекомендуется использовать автоматический или полуавтоматический промыватель – вошер; в случае отсутствия вошера можно промывать лунки 8-канальной пипеткой;

- на всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

- необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок;

- необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;

- при каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

- некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

 

8  Проведение анализа

8.1  В лунки иммуносорбента внести контрольные образцы. Схема внесения контрольных образцов в лунки иммуносорбента при постановке анализа:

а) при постановке ИФА на полном планшете иммуносорбента или на двух и более стрипах: в любые две лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) К+, в три другие лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) К, в одну лунку иммуносорбента внести 0,1 мл (100 мкл) РР-С для контроля конъюгата (ККг);

б) при постановке ИФА на одном стрипе в любую одну лунку иммуносорбента внести 0,1 мл (100 мкл) К+, в две другие лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) К, в одну лунку иммуносорбента внести 0,1 мл (100 мкл) РР-С для контроля конъюгата (ККг);

8.2  В остальные лунки внести по 0,09 мл (90 мкл) РР-С, затем внести по 0,01 мл (10 мкл) образцов исследуемой сыворотки (плазмы) крови человека (п 6.5) (конечное разведение исследуемых образцов – 1:100). Раствор в каждой лунке перемешать пять раз пипетированием, при этом во время пипетирования цвет РР-С должен измениться!

Внимание! Общее время внесения в лунки иммуносорбента контрольных и исследуемых образцов не должно превышать (5-10) мин! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

8.3  Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 45 мин.

8.4  Удалить содержимое лунок иммуносорбента с помощью промывателя, затем промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) пять раз. Для этого необходимо внести во все лунки по (0,30-0,35) мл раствора, а затем удалить содержимое лунок иммуносорбента в емкость с дезраствором. По окончании промывания тщательно удалить остатки жидкости из лунок, постукивая планшетом иммуносорбента в перевернутом положении (лунками вниз) по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена.

8.5  Во все лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) раствора Кг в рабочем разведении (п 6.6). Раствор Кг в рабочем разведении (РК) перед внесением в лунки иммуносорбента перелить из флакона в прилагаемую к набору пластиковую ванночку.

Внимание! Раствор Кг в рабочем разведении  необходимо вносить в лунки иммуносорбента с использованием одноразовых наконечников, прилагаемых к набору!

8.6  Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 45 мин.

8.7  Удалить содержимое лунок иммуносорбента с помощью промывателя, затем промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) пять раз.

8.8  Во все лунки иммуносорбента внести по 0,1 мл (100 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.7).

Флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения кристаллов. Рабочий раствор субстрата  перед внесением в лунки иммуносорбента перелить из флакона в прилагаемую к набору пластиковую ванночку.

Внимание! Рабочий раствор субстрата  необходимо вносить в лунки иммуносорбента с использованием одноразовых наконечников, прилагаемых к набору!

8.9  Планшет иммуносорбента инкубировать при температуре (37±1) °С в защищенном от света месте в течение 15 мин.

Внимание! По окончании инкубации в лунках иммуносорбента с образцами сывороток, содержащими антитела класса М к ВПГ-I/II, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации антител: от бесцветной до голубой .

8.10  Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки иммуносорбента по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента.

Внимание! В лунках иммуносорбента с образцами сывороток, содержащими антитела класса М к ВПГ-I/II, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации антител с голубой (синей) на желтую.

8.11 Не позже чем через 10 мин после остановки реакции определить значения ОП, ОЕ, в лунках иммуносорбента: в двухволновом режиме – 450 нм относительно (620-700) нм. Допускается измерение ОП в лунках иммуносорбента в одноволновом режиме при длине волны 450 нм .

 

9  Обработка результатов анализа

9.1  Рассчитать среднее значение ОП для лунок с К- (ОПср К-), ОЕ, и для лунок с К+       (ОПср К+).

9.2  Результаты учитывать только в том случае если:

- значение ОПср К+не менее чем в 4 раза превышает значение ОПср К-, ОЕ;

- значение ОПср К-не более 0,200 ОЕ;

- значение ОП в лунке с контролем конъюгата (ОП ККг) – не более 0,150 ОЕ.

9.3  При соблюдении выше перечисленных условий вычислить критическое значение (ОПкрит.), ОЕ, по формуле (1):

 

ОПкрит. = ОПср К-+ 0,20                                                                               (1).

 

Результат анализа на данном наборе реагентов считать отрицательным, если значение ОП исследуемого образца сыворотки (плазмы) крови человека, ОЕ, меньше значения ОПкрит.

Результат анализа на данном наборе реагентов считать положительным, если значение ОП исследуемого образца сыворотки (плазмы) крови человека, ОЕ, больше или равно значению ОПкрит.

 

10  Форма выпуска набора

10.1  Набор поставляется в двух вариантах комплектации:

комплект 1 – для проведения анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

комплект 2 – для проведения анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы.

 

11  Условия хранения и применения набора

11.1  Хранение набора должно производиться в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре                 (2-8) °С в течение всего срока годности.

Запрещается замораживать компоненты набора.

11.2  Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

11.3  Срок годности набора – 12 месяцев.

 

 

 

 

Приложение А

 

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

 

Объем

реагента, мл

Количество используемых стрипов, шт.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Приготовление раствора для промывания планшета

ФСБ-Т×25

2,0

4,0

6,0

8,0

10,

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

28,0

Дистиллированная

вода

до

50

до

100

до

150

до

200

до

250

до

300

до

350

до

400

до

450

до

500

до

550

до

700

Приготовление раствора Кг в рабочем разведении

РР-К

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

13,0

Кг

0,023

0,046

0,069

0,092

0,115

0,138

0,162

0,185

0,208

0,231

0,254

0,300

Приготовление рабочего раствора субстрата

БРС

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

13,0

Хромоген ТМБ

0,031

0,062

0,093

0,124

0,155

0,186

0,217

0,248

0,279

0,310

0,341

0,400

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Библиография

 

[1]

 

Санитарные правила

СП 17-69 РБ 98 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 29.04.1998 № 18

[2]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 16.12.1998 г. № 351

О пересмотре ведомственных нормативных актов, регламентирующих вопросы по проблеме ВИЧ/СПИД

[3]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 25.11.2002 г. № 165

О проведении дезинфекции и стерилизации учреждениями здравоохранения

[4]

Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 28.04.2010 г. № 47

Об утверждении Инструкции о порядке проведения обязательных медицинских осмотров работающих и признании утратившими силу некоторых постановлений Министерства здравоохранения Республики Беларусь

[5]

Санитарные нормы и правила

СанПиН № 2.1.7.14-20-2005 «Правила обращения с медицинскими отходами»

 

 

 

Изготовитель   СП ООО «Фармлэнд» Почтовый адрес:220113 г. Минск, ул. Восточная, 129. Тел\факс (017) 2621417.

По вопросам применения и качества набора обращаться на предприятие-изготовитель СП ООО «Фармлэнд».