ИФА-HIV 1,2 AGAT

Вы здесь

ИФА-HIV 1,2 AGAT

Торговое наименование: 
ИФА-HIV 1,2 AGAT
Международное наименование: 
ИФА-HIV 1,2 AGAT
Категория: ИФА тест-системы
Назначение: Для диагностики ВИЧ-инфекции

Описание

1  Назначение набора

1.1  Набор предназначен для одновременного выявления антител к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотке и плазме крови человека “in vitro” методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

 

2  Характеристика и принцип работы набора

2.1  Состав набора:

Наименование компонента

Количество

Иммуносорбент

2 планшета

Положительный контрольный образец АТ +АТ)

1 флакон, 3 мл

Положительный контрольный образец АГ +АГ)

3 флакона, лиофилизованный препарат

Отрицательный контрольный образец )

2 флакона по 3 мл

Раствор конъюгата №1 (РК-1)

1 флакон, 12 мл

Конъюгат №2 (Кг-2)

1 флакон, 1 мл

Раствор для разведения конъюгата №2 (РР-К2)

2 флакона по 18 мл

Буферный раствор для субстрата (БРС)

2 флакона по 18 мл

Хромоген ТМБ

1 флакон, 1 мл

Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25)

2 флакона по 50 мл

Стоп-реагент

1 флакон, 12 мл

Комплект ванночки для реагентов с наконечниками для многоканальных пипеток

1 комплект

Клейкая пленка

6 штук

2.2  Основные компоненты набора " ИФА-HIV 1,2 AGAT " – иммуносорбент, раствор конъюгата №1 и конъюгат №2.

Иммуносорбент представляет собой полистироловый планшет, в лунках которого сорбирована смесь рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 (gp41) и ВИЧ-2 (gp36) и моноклональных антител к антигену р24 ВИЧ-1.

Раствор конъюгата №1 представляет собой смесь меченых биотином моноклональных человеческих антител против антигена р24 ВИЧ-1 и меченых биотином рекомбинантных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Конъюгат №2 представляет собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец АТ – сыворотка крови человека, содержащая антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, не содержащая антитела к вирусу гепатита С и Treponema pallidum, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Положительный контрольный образец АГ – сыворотка крови человека содержащая нативный антиген р24 ВИЧ-1, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета раствора конъюгата №1 и образцов сывороток инфицированной крови антиген р24 связывается как со специфическими антителами на твердой фазе, так и с моноклональными биотинилированными анти-р24 антителами, входящими в состав раствора конъюгата №1; ВИЧ-специфические антитела связываются как с рекомбинантными антигенами ВИЧ-1 и ВИЧ-2, сорбированными на твердой фазе, так и с антигенами, входящими в состав раствора конъюгата №1, образуя комплексы антиген-антитело. Иммунные комплексы анти-р24 специфических антител и антигена р24 выявляются конъюгатом №2. После отмывания несвязавшихся компонентов в лунки планшета добавляют раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена ТМБ.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты), и интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации специфических антител и/или антигена р24 в образце сыворотки или плазмы. Чем выше содержание антител и/или антигена р24 в образце сыворотки, тем выше интенсивность окрашивания.

2.3  Набор рассчитан на проведение на проведение 24 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего –              192 определений, включая контрольные образцы.

 

3  Меры предосторожности при работе с набором

3.1  Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

- работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

- работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями [1], [2], и [3].

3.2  Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.

3.3  При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4  Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями [4].

3.5  Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями [5].

 

4  Правила работы с набором

4.1  Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение (5-10) мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сывороток можно хранить при температуре (2-8) °С не более 5 сут. Замороженные образцы (желательно до температуры не менее минус 20 °С) можно хранить не более 1 года. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

- не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

- для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

- всю используемую для приготовления реагентов посуду не обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

- для работы с хромогеном ТМБ и РХ необходимо использовать отдельные емкости для растворов, наконечники для пипеток, посуду.

- необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

- время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

- при использовании промывателя следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

- необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

- дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

- для работы с исследуемыми и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником.

- при внесении в лунки РК-1 нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета и раствора, находящегося в лунках.

- во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

4.2  При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

 

5  Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1  Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 450 нм;

- полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

- суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;

- пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости                    от 0,01 до 5,0 мл;

- пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;

- мерный цилиндр вместимостью 2000 мл;

- колба лабораторная вместимостью 2000 мл;

- флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

- ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

- вата медицинская гигроскопическая;

- бумага фильтровальная;

- перчатки резиновые хирургические;

- раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;

- раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

- вода деионизированная или дистиллированная;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива жидких отходов.

 

6  Подготовка к проведению анализа

6.1  Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин.

Все образцы сывороток (плазмы) и реагенты перед проведением анализа тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2  Приготовление раствора для промывания планшета

Внимание! Раствор для промывания планшета готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка. В мерный цилиндр вместимостью 2000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной воды до метки 1250 мл и аккуратно перемешать раствор. Раствор можно хранить при температуре (2-8) °С в течение 72 ч.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица А.1) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной воды и перемешать раствор. Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3  Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С в течение 3 месяцев.

6.4  Подготовка К+АТ, К, РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагента

К+АТ, К, РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Внимание! Во флаконе с РК-1 возможно выпадение осадка. Для проведения анализа необходимо использовать надосадочную жидкость.

Неиспользованные РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К+АТ и К- после вскрытия флакона можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5  Приготовление раствора К+АГ

Внимание! Раствор К+АГ готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Для восстановления лиофилизированного К+АГ перед вскрытием флакона легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флакона или пробки. Открыть флакон и положить пробку перевернутой на сухую поверхность. Внести во флакон 0,8 мл дистиллированной воды. Флакон закрыть пробкой, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флакон, перемешать его содержимое до полного растворения, избегая образования пены.

Восстановленный К+АГ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение одного месяца, при температуре минус 20 °С – в течение шести месяцев. Допускается однократное замораживание-оттаивание восстановленного К+АГ.

6.6  Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

Из флакона с Кг-2 отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с РР-К2. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К2, добавить Кг-2 в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг-2 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием! Раствор Кг-2 в рабочем разведении можно хранить в течение 15 мин при температуре (18-25) °С. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг-2 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.7  Приготовление рабочего раствора субстрата

 Флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения кристаллов.

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромогена ТМБ в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить в течение 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

 

7   Требования к промыванию планшета

7.1  Для промывания планшета рекомендуется использовать автоматический или полуавтоматический промыватель – вошер; в случае отсутствия вошера можно промывать лунки 8-канальной пипеткой;

- на всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

- необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок;

- необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;

- при каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

- некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

 

8  Проведение анализа

8.1  В любые две лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) К+АТ, в две другие лунки– по 0,07 мл (70 мкл) К+АГ, в три другие лунки – по 0,07 мл (70 мкл) К.

Внимание! При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать для К - две лунки, для К+АТ – одну лунку, для К+АГ – одну лунку.

В остальные лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови человека.

Внимание! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

8.2  Во все лунки планшета поверх контрольных образцов и исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови сразу внести по 0,05 мл (50 мкл) РК-1. Содержимое лунок перемешать осторожным постукиванием по краям планшета.

8.3  Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 60 мин.

Внимание! За (1-2) мин до окончания инкубации приготовить раствор Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.4  Удалить содержимое лунок с помощью промывателя, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.5  Внести во все лунки планшета по 0,15 мл (150 мкл) раствора Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.6  Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 10 мин.

8.7  Удалить содержимое лунок планшета с помощью промывателя, затем промыть лунки планшетов раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.8  Во все лунки планшета внести по 0,15 мл (150 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.7).

При приготовлении рабочего раствора субстрата (п.6.7) флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37±1)° С до полного растворения кристаллов.

8.9  Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в защищенном от света месте в течение 15 мин.

Внимание! По окончании инкубации в лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора от бесцветной до голубой различной интенсивности в зависимости от концентрации антител и/или антигена в исследуемом образце сыворотки.

8.10  Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента.

Внимание! В лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора с голубой на желтую различной интенсивности.

8.11  Не позже чем через (1-2) мин после остановки реакции определить ОП в лунках в одноволновом режиме при длине волны 450 нм.

 

9  Обработка результатов анализа

9.1  Рассчитать среднее значение ОП для лунок с К- – ОПср К-, ОЕ; для лунок с К+АТ – ОПср К+АТ, ОЕ; для лунок с К+АГ – ОПср К+АГ, ОЕ.

9.2  Результаты учитывать только в том случае если:

- значение ОПср К- не превышает 0,2 ОЕ;

- каждое отдельное значение ОП К- не должно отклоняться от ОПср К- более чем на 30%. Если одно из трех значений   ОП К- выходит за этот предел, его следует исключить из расчета ОПср К-. Если два из трех значений ОП К- выходят за этот предел, анализ следует повторить на реагентах нового набора;

- значение ОПср К+АТ более 1,0 ОЕ;

- значение ОПср К+АГ более 1,0 ОЕ.

9.3  При соблюдении выше перечисленных условий вычислить критическое значение (ОПкрит.), ОЕ, по формуле (1):

 

ОПкрит. = ОПср К-+ 0,14                                                                 (1).

 

Результат теста считать положительным при анализе на данном наборе реагентов, если значение ОП исследуемого образца сыворотки (плазмы) крови человека равно или больше значения ОПкрит.

Результат теста считать отрицательным при анализе на данном наборе реагентов, если значение ОП исследуемого образца сыворотки (плазмы) крови человека меньше значения ОПкрит.

 

10 Аналитические и диагностические характеристики                  

       Чувствительность набора реагентов  ИФА-HIV 1,2 AGAT по выявлению антигена р24 ВИЧ-1 –

 менее или равна 10 пг/мл.

       Специфичность набора реагентов  ИФА-HIV 1,2 AGAT – 100 % Стандарт АТ(-)ВИЧ. Стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1,2) и антиген ВИЧ-1(р24).ОСО42-28-214-02П.Кат№INS-20. ЗАО «МБС».

 

 

 

 

11  Форма выпуска набора

11.1  Набор выпускается в пяти вариантах комплектации:

комплект 1Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

комплект 2М – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

комплект 2Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

комплект А2М – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

комплект А2Р – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы.

 

12 Условия хранения и применения набора

12.1  Хранение набора должно производиться в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре (2-8)° С в течение всего срока годности. Запрещается замораживать компоненты набора.

12.2  Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

12.3  Срок годности набора – 12 месяцев.

 

Приложение А

 

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

Объем

реагента, мл

Количество используемых стрипов, шт.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Приготовление раствора для промывания планшета

ФСБ-Т×25

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

50

Дистиллированная

вода

до

100

до

200

до

300

до

400

до

500

до

600

до

700

до

800

до

900

до

1000

до

1100

до

1250

Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

РР-К2

1,5

3,0

4,5

6,0

7,5

9,0

10,5

12,0

13,5

15,0

16,5

18,0

Кг-2

0,033

0,068

0,100

0,133

0,165

0,200

0,230

0,270

0,300

0,330

0,370

0,400

Приготовление рабочего раствора субстрата

БРС

1,5

3,0

4,5

6,0

7,5

9,0

10,5

12,0

13,5

15,0

16,5

18,0

Хромоген ТМБ

0,033

0,068

0,100

0,133

0,165

0,200

0,230

0,270

0,300

0,330

0,370

0,400

 

Библиография

 

[1]

 

Санитарные правила

СП 17-69 РБ 98 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 29.04.1998 № 18

[2]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 16.12.1998 г. № 351

О пересмотре ведомственных нормативных актов, регламентирующих вопросы по проблеме ВИЧ/СПИД

[3]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 25.11.2002 г. № 165

О проведении дезинфекции и стерилизации учреждениями здравоохранения

[4]

Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 28.04.2010 г. № 47

Об утверждении Инструкции о порядке проведения обязательных медицинских осмотров работающих и признании утратившими силу некоторых постановлений Министерства здравоохранения Республики Беларусь

[5]

Санитарные нормы и правила

СанПиН № 2.1.7.14-20-2005 «Правила обращения с медицинскими отходами»

 

Изготовитель  СП ООО «Фармлэнд»  Почтовый адрес:  220113 г. Минск, ул. Восточная, 129. Тел\факс (017) 262-14-17.

По вопросам применения и качества набора обращаться на предприятие-изготовитель СП ООО «Фармлэнд».