ИФА-HBsAg

ИФА-HBsAg

Торговое наименование: 
ИФА-HBsAg
Международное наименование: 
ИФА-HBsAg
Категория: ИФА тест-системы
Назначение: Для диагностики вирусных гепатитов B,C

Описание

1  Назначение набора

1.1  Набор предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HВsAg) в сыворотке или плазме крови человека “in vitro” методом твердофазного иммуноферментного «сэндвич»-анализа.

2  Характеристика и принцип работы набора

2.1  Состав набора:

Наименование компонента

Количество

Иммуносорбент

2 планшета

Положительный контрольный образец (К+)

1 флакон, 3 мл

Отрицательный контрольный образец (К)

1 флакон, 3 мл

Слабоположительный контрольный образец (Ксл+)

4 флакона

Конъюгат №1 (Кг-1)

1 флакон, 1,5 мл

Раствор для разведения конъюгата №1 (РР-К1)

2 флакона по 6 мл

Конъюгат №2 (Кг-2)

1 флакон, 1,5 мл

Раствор для разведения конъюгата №2 (РР-К2)

2 флакона по 6 мл

Буферный раствор для субстрата (БРС)

2 флакона по 13 мл

Хромоген ТМБ

1 флакон, 1,0 мл

 

25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25)

2 флакона по 28 мл

Стоп-реагент

1 флакон, 12 мл

Комплект ванночки для реагентов с наконечниками для многоканальных пипеток

3 комплекта

Клейкая пленка

3 штуки

2.2  Основные компоненты набора "ИФА-HBsAg" – иммуносорбент, конъюгат №1 и конъюгат №2.

Иммуносорбент представляет собой полистирольный планшет, в лунках которого сорбированы поликлональные антитела к HВs-антигену.

Конъюгат №1 представляет собой меченые биотином моноклональные антитела к HBs-антигену.

Конъюгат №2 представляет собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец – сыворотка крови человека, содержащая НВs-антиген, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вирусу гепатита С, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая НВs-антиген, антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Слабоположительный контрольный образец – лиофилизированный препарат сыворотки крови человека, содержащей рекомбинантный НВs-антиген с концентрацией 0,25 нг/мл, не содержащей антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и НВs-антиген, инактивированной прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета конъюгата №1 и образцов сывороток (плазмы) инфицированной крови HВs-антиген связывается как с поликлональными антителами к HВs-антигену, сорбированными на твердой фазе, так и с моноклональными антителами к HBs-антигену, входящими в состав конъюгата №1, образуя комплексы антитело-антиген-конъюгат. Иммунные комплексы антитело-антиген-конъюгат выявляются конъюгатом №2. После отмывания несвязавшихся компонентов связавшийся конъюгат №2 выявляют, добавляя в лунки планшета раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена ТМБ.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты), и интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации HВs-антигена в образце сыворотки или плазмы крови человека. Чем выше содержание HВs-антигена в образце сыворотки, тем выше интенсивность окрашивания.

2.3  Набор рассчитан на проведение 24 постановоки ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определения, включая контрольные образцы.

3  Меры предосторожности при работе с набором

3.1  Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

- работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

- работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями [1], [2], и [3].

3.2  Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.

3.3  При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4  Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями [4].

3.5  Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями [5].

4  Правила работы с набором

4.1  Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение 15 мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сывороток можно хранить при температуре (2-8) °С не более 7 суток. Замороженные образцы (желательно до температуры не менее минус 20 °С) можно хранить не более 6 месяцев. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

- не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

- для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

- всю используемую для приготовления реагентов посуду не обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

- для работы с хромогеном ТМБ необходимо использовать отдельные емкости для растворов, наконечники для пипеток, посуду.

- необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

- при внесении в лунки стрипов раствора Кг-1 в рабочем разведении или раствора Кг-2 в рабочем разведении нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета и раствора, находящегося в лунках во избежание случайного заноса образца из одного стрипа в другой через наконечники;

- время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

- при использовании промывателя следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

- необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

- дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

- для работы с исследуемыми сыворотками и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником.

- во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

4.2  При вскрытии и растворении лиофилизированных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

5  Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1  Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 450 нм;

- полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

- суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;

- пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,02 до 5,0 мл;

- пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;

- мерный цилиндр вместимостью 1000 мл;

- колба лабораторная вместимостью 1000 мл;

- флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

- ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

- вата медицинская гигроскопическая;

- бумага фильтровальная;

- перчатки резиновые хирургические;

- раствор с объемной долей спирта этилового 70 %;

- раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

- вода деионизированная или дистиллированная;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива жидких отходов.

 

 

 

6  Подготовка к проведению анализа

6.1  Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин.

Содержимое флаконов с реагентами, входящими в состав набора, и все образцы исследуемых сывороток (плазмы) крови человека перед проведением анализа тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2  Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С в не более 3 месяцев.

6.3  Приготовление раствора для промывания планшета

Внимание! Раствор для промывания планшета готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка.

В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной воды до метки 700 мл и аккуратно перемешать раствор.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица A.1 Приложения А) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной воды и перемешать раствор.

Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.4  Подготовка К+, К, РР-К1, РР-К2, БРС и стоп-реагента

К+, К, РР-К1, РР-К2, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Неиспользованные РР-К1, РР-К2, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в плотно закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К+ и К- после вскрытия флаконов можно хранить в плотно закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5  Приготовление раствора Ксл+

Внимание! Раствор Ксл+ готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Для восстановления лиофилизированного Ксл+ перед вскрытием флакона легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флакона или пробки. Открыть флакон и положить пробку перевернутой на сухую поверхность. Внести во флакон 1,0 мл дистиллированной воды. Флакон закрыть пробкой, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флакон, перемешать его содержимое до полного растворения, избегая образования пены. В течение следующих 10 мин выдержать флакон при температуре (18-25)°С, периодически перемешивая его содержимое.

Восстановленный Ксл+ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С не более 1 месяца , при температуре минус 20 °С – в течение шести месяцев. Допускается однократное замораживание-оттаивание восстановленного Ксл+.

6.6  Приготовление раствора Кг-1 в рабочем разведении

Из флакона с Кг-1 отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с РР-К1. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К1, добавить Кг-1 в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг-1 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием! Раствор Кг-1 в рабочем разведении можно хранить в течение 5 мин при температуре (18-25) °С. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг-1 можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.7  Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

Из флакона с Кг-2 отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с РР-К2. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К2, добавить Кг-2 в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг-2 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием! Раствор Кг-2 в рабочем разведении можно хранить в течение 5 мин при температуре (18-25) °С. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг-2 можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.8  Приготовление рабочего раствора субстрата

Флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37±1)° С до полного растворения кристаллов.

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон из темного стекла или пластика (прозрачный флакон обернуть флакон) отобрать необходимое количество БРС, добавить хромоген ТМБ в соответствии с таблицей A.1 Приложения А и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить в течение 5 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

7   Требования к промыванию планшета

7.1  Для промывания планшета рекомендуется использовать автоматический или полуавтоматический промыватель – вошер; в случае отсутствия вошера можно промывать лунки 8-канальной пипеткой;

- на всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

- необходимо при каждом промывании во все лунки планшета вносить не менее 380 мкл раствора для промывания планшета;

- необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;

- при каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

- некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

8  Проведение анализа

8.1 В лунки, предназначенные для контрольных образцов внести:

- в две лунки планшета – по 0,1 мл (100 мкл) К+;

- в две лунки планшета – по 0,1 мл (100 мкл) Ксл+;

- в две лунки планшета – по 0,1 мл (100 мкл) К.

Во все остальные лунки планшета внести по 0,1 мл (100 мкл) исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови человека.

Внести во все лунки планшета по 0,05 мл (50 мкл) раствора Кг-1 в рабочем разведении (п 6.6).

Внимание! При постановке ИФА на одном или двух стрипах допускается использовать для К – две лунки, для К+ – одну лунку, для Ксл+ – одну лунку.

Внимание! Время внесения контрольных и исследуемых образцов не должно превышать (5-10) мин! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

Содержимое лунок перемешать осторожным постукиванием по краю планшета

8.2  Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать при температуре (37±1) °С в течение 60 мин в термостате.

Внимание! За (1-2) мин до окончания инкубации приготовить раствор Кг-2 в рабочем разведении (п 6.7).

8.3  По окончании инкубации внести во все лунки планшета по по 0,05 мл (50 мкл) раствора Кг-2 в рабочем разведении (п 6.7). Содержимое лунок перемешать осторожным постукиванием по краю планшета

8.4  Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать при температуре (37±1) °С в течение 30 мин в термостате.

8.5  Удалить содержимое лунок, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.3) семь раз. Для этого во все лунки планшета необходимо внести не менее 380 мкл раствора для промывания планшета, а затем удалить содержимое лунок в емкость с дезраствором.

По окончании промывания тщательно удалить остатки жидкости из лунок, активно постукивая планшетом в перевернутом положении (лунками вниз) по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена.

8.6  Во все лунки планшета внести по 0,1 мл (100 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.8). При приготовлении рабочего раствора субстрата (п.6.8) флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37±1)° С до полного растворения кристаллов

8.7  Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в защищенном от света месте в течение 15 мин.

Внимание! По окончании инкубации в лунках с образцами сывороток, содержащими HBs-антиген, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации HBs-антигена в исследуемом образце сыворотки: от бесцветной до голубой.

8.8  Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента.

Внимание! В лунках с образцами сывороток, содержащими HBs-антиген, произойдет изменение окраски раствора: с голубой на желтую.

8.9  Не позже чем через 10 мин после остановки реакции определить значение ОП раствора в лунках в двухволновом режиме: 450 нм относительно (620-700) нм. Допускается измерение ОП в одноволновом режиме при длине волны 450 нм.

 

9  Обработка результатов анализа

9.1  Рассчитать среднее значение ОП для лунок с К- – ОПср К-, ОЕ; для лунок с К+ – ОПср К+, ОЕ; для лунок с Ксл+ – ОПср Ксл+, ОЕ.

9.2  Результаты учитывать только в том случае если:

- значение ОПср К- – не более 0,2 ОЕ;

- значение ОПср К+ – не менее 1,0 ОЕ;

- значение ОПср Ксл+ более значения ОПкрит.

Критическое значение (ОПкрит.), ОЕ, рассчитать по формуле (1):

 

ОПкрит. = ОПср К-+ 0,06                                                                             (1).

 

9.3  Для интерпретации результатов необходимо рассчитать для каждого исследуемого образца сыворотки (плазмы) крови значение коэффициента позитивности (КП) по формуле (2):

ОП образца

КП = _______________________                                                                              (2).

ОПкрит.

Результат анализа считать положительным (в сыворотке (плазме) крови содержится поверхностный HBs-антиген вируса гепатита В), если значение КП исследуемого образца равен или больше 1,0.

Результат анализа считать отрицательным, если значение КП исследуемого образца сыворотки (плазмы) крови меньше 1,0.

При получении положительного результата этот же образец сыворотки исследовать повторно. При повторном получении положительного результата исследовать сыворотку (плазму) крови в подтверждающих тест-системах на HBs-антиген.

 

Чувствительность набора – не менее 0,01 нг/мл и специфичность набора – 100 % 

по стандарту WHO International Standart Second International Standart(2003) for HBsAg.subtype adw2.genotipe A NIBSC code 00/588.

 

10  Форма выпуска набора

11.1  Набор выпускается в трех вариантах комплектации:

комплект 1 – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

комплект 2 – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

комплект 3 – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы.

11  Условия хранения и применения набора

11.1  Хранение набора должно производиться в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре          (2-8) °С в течение всего срока годности.

Запрещается замораживать компоненты набора.

11.2  Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

11.3  Срок годности набора – 12 месяцев.

Приложение А

 

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

Объем

реагента, мл

Количество используемых стрипов, шт.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Приготовление раствора для промывания планшета

ФСБ-Т×25

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

28

Дистиллиров.

вода

до

50

до

100

до

150

до

200

до

250

до

300

до

350

до

400

до

450

до

500

до

550

до

700

Приготовление раствора Кг-1 в рабочем разведении

РР-К1

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

Кг-1

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

РР-К2

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

Кг-2

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

Приготовление рабочего раствора субстрата

БРС

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

13

Хромоген ТМБ

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0,18

0,21

0,24

0,27

0,30

0,33

0,40

 

Библиография

 

[1]

 

Санитарные правила

СП 17-69 РБ 98 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 29.04.1998 № 18

[2]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 16.12.1998 г. № 351

О пересмотре ведомственных нормативных актов, регламентирующих вопросы по проблеме ВИЧ/СПИД

[3]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 25.11.2002 г. № 165

О проведении дезинфекции и стерилизации учреждениями здравоохранения

[4]

Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 28.04.2010 г. № 47

Об утверждении Инструкции о порядке проведения обязательных медицинских осмотров работающих и признании утратившими силу некоторых постановлений Министерства здравоохранения Республики Беларусь

[5]

Санитарные нормы и правила

СанПиН № 2.1.7.14-20-2005 «Правила обращения с медицинскими отходами»

 

 

 

Изготовитель  СП ООО «Фармлэнд»  Почтовый адрес:  220113 г. Минск, ул. Восточная, 129. Тел\факс (017) 262-14-17.

По вопросам применения и качества набора обращаться на предприятие-изготовитель СП ООО «Фармлэнд».