ИФА-Аллерго IgE

Вы здесь

ИФА-Аллерго IgE

Торговое наименование: 
ИФА-Аллерго IgE
Международное наименование: 
ИФА-Аллерго IgE
Категория: ИФА тест-системы
Назначение: Для диагностики аллергических заболеваний

Описание

 

1.1  Набор предназначен для количественного определения концентрации аллерген-специфических иммуноглобулинов Е (далее – специфический IgE) к лекарственным веществам, клещевым аллергенам, эпидермальным аллергенам и белкам животного происхождения, пищевым аллергенам, луговым травам, аллергенам домашней пыли, ядам насекомых, профессиональным аллергенам, плесневым и дрожжевым грибам, паразитарным аллергенам, пыльце деревьев, сорным травам и комбинациям из них в сыворотке крови “in vitro” методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2  Иммуноглобулины класса E участвуют в возникновении и развитии аллергических реакций. Эти антитела, связывая аллерген, приобретают способность стимулировать выделение базофилами ряда вазоактивных веществ, которые определяют развитие аллергической симптоматики. Выявление и количественное определение концентрации свободных аллерген-специфических IgE имеет большое значение при диагностике и исследовании аллергических заболеваний, для выбора адекватной терапии.

 

2  Характеристика и принцип работы набора

2.1  Состав набора:

Наименование компонента

Количество

Иммуносорбент

1 комплект

Калибровочная проба С0

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Калибровочная проба С1

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Калибровочная проба С2

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Калибровочная проба С3

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Калибровочная проба С4

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Калибровочная проба С5

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Контрольная сыворотка

1 флакон; 0,5 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Конъюгат № 1 (Кг-1)

1 флакон; 7,0 мл

Конъюгат № 2 (Кг-2)

1 флакон; 18,0 мл

20-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×20)

2 флакона по 14 мл

Раствор тетраметилбензидина (Раствор ТМБ)

1 флакон, 14 мл

Стоп-реагент

1 флакон; 14 мл

Закрывающийся пакет из полиэтиленовой пленки

1 пакет

Биотинилированные аллергены групп C, D, E, F, G, H, I, K, M, P, T, W и комбинации из них

1 флакон; 3,0 мл или

1 флакон, лиофилизованный препарат

Примечания

1  Точные значения концентрации IgE в калибровочных пробах и контрольной сыворотке указаны на этикетках флаконов.

2  Закрывающийся пакет из полиэтиленовой пленки входит в состав набора при упаковывании иммуносорбента в пакет из 2-слойного полиэтилена.

3  Комплектация поставки зависит от индивидуальной заявки потребителя. Необходимая панель биотинилированных аллергенов для индивидуального тестирования составляется на основании общего перечня биотинилированных аллергенов, указанных в таблице А.1 Приложения А. Биотинилированные аллергены могут поставляться отдельно. На этикетках флаконов с биотиниллированными аллергенов указаны кодовые номера и названия биотинилированных аллергенов.

 

2.3  Основные компоненты набора «ИФА-Аллерго IgE» – иммуносорбент и конъюгат № 1 и конъюгат № 2.

Иммуносорбент представляет собой комплект из двенадцати восьмилуночных полистирольных стрипов, в лунках которых сорбированы мышиные моноклональные антитела к общему IgE.

Конъюгат № 1 представляет собой мышиные моноклональные антитела к общему IgE человека, конъюгированные с биотином.

Конъюгат № 2 представляет собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Калибровочные пробы – на основе сыворотки крови крупного рогатого скота или водно-солевого раствора, содержащие известные количества общего IgE, аттестованные по Второму международному стандарту WHO (The 2nd International Reference Preparation Human Serum Immunoglobulin E, 75/502).

Контрольная сыворотка – на основе сыворотки крови человека или водно-солевого раствора с известным содержанием общего IgE.

Биотинилированные аллергены групп C, D, E, F, G, H, I, K, M, P, T, W и комбинации из них представляет собой аллергены групп C, D, E, F, G, H, I, K, M, P, T, W и комбинации из них, конъюгированные с биотином.

2.4  Принцип работы набора. В наборе «ИФА-Аллерго IgE» для выявления IgE-антител, специфичных к конкретным аллергенам, использованы два варианта твердофазного иммуноферментного анализа (Рис. 1).

В лунках, предназначенных для калибровочных проб, реализован «сэндвич»-вариант анализа. Для этого использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к иммуноглобулинам класса Е, а также конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена. Одно из моноклональных антител иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок) (на Рис.1 – мышиные IgG против IgE человека), второе конъюгировано с эфиром биотина (на Рис.1 – биотиниллированные мышиные IgG против IgE человека). Во время первой инкубации в этих лунках одновременно происходят иммобилизация на твердой фазе и связывание с конъюгатом анти-IgE-биотин молекул IgE (Конъюгат № 1) (на Рис. 1 – IgE человека общий), содержащихся в калибровочных пробах. В лунках, предназначенных для образцов сыворотки крови, реализован «ловушечный»-вариант иммуноферментного анализа.

Для выявления IgE к конкретным аллергенам (на Рис. 1 – IgE человека специфический) используются одно моноклональное антитело, специфичное к иммуноглобулинам класса Е, и иммобилизованное на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок) (на Рис. 1 - мышиные IgG против IgE человека), а также биотинилированные аллергены по выбору лечащего врача вместо Конъюгата № 1, и конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (Конъюгат № 2). В лунках с исследуемыми образцами во время первой инкубации происходит иммобилизация разных молекул IgE, содержащихся в сыворотке крови, на твердой фазе. Если среди них имеются IgE, специфичные к выбранным аллергенам, то одновременно происходит их связывание с биотинилированным аллергеном.

 

 

Рисунок 1 – Схема анализа

 

При промывке планшета иммуносорбента из лунок с калибровочными пробами удаляется избыток Конъюгата № 1, из лунок с образцами сыворотки крови – избыток биотинилированных аллергенов. Во время второй инкубации Конъюгат № 2 связывается с биотинилированными антителами в лунках калибровочных проб и с биотинилированным аллергеном в лунках с исследуемыми образцами. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка Конъюгата № 2. Количество связавшегося аллергена и Конъюгата № 2 прямо пропорционально количеству специфических IgE в исследуемых образцах.

Во время инкубации с ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного Конъюгата № 2. После измерения оптической плотности (ОП), раствора в лунках, ОЕ, на основании калибровочных графиков, построенных с использованием значений ОП, полученных при длинах волн 450 нм и 405 нм, рассчитывается концентрация специфических IgE в исследуемых образцах сыворотки крови человека.

2.4  Набор рассчитан на проведение анализа в монопликатах 80 неизвестных проб и в дубликатах 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для измерения значения ОП раствора ТМБ. Всего – 96 определений при использовании всех стрипов одновременно.

Набор рассчитан на 4 постановки иммуноферментного анализа: 1 постановка – 3 стрипа (24 лунки).

Один флакон биотинилированного аллергена рассчитан на проведение анализа в монопликатах 26 проб образцов сыворотки крови человека.

ПримечаниеВ случае дробного применения набор может быть использован только в течение 2 месяцев после вскрытия компонентов набора.

2.5  Набор позволяет определять концентрацию IgE в сыворотке крови человека в диапазоне от 0,15 до 100 МЕ/мл.

2.6  Продолжительность анализа составляет 1 ч 45 мин.

 

3  Меры предосторожности при работе с набором

3.1  Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

- работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

- работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями [1], [2], и [3].

3.2  Стоп-реагент, представляет собой 1Н раствор соляной кислоты и обладает раздражающим действием. В случае попадания стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо немедленно промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

3.3  При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4  Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями [4].

3.5  Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями [5].

 

4  Правила работы с набором

4.1  Для исключения ложных результатов исследуемые образцы сыворотки крови человека необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сыворотки крови человека, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение 5 мин при скорости вращения (1000-1500) об/мин. Образцы сыворотки крови человека можно хранить при температуре (2-8) °С не более           48 ч. При необходимости более длительного хранения (до 3 месяцев) рекомендуется аликвотировать образец и хранить в замороженном виде при температуре минус 20 °С и ниже. Не допускается повторное замораживание образца.

Для проведения анализа не следует использовать плазму крови человека, образцы сыворотки крови человека с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, содержащие азид натрия, а также длительно хранившиеся без замораживания.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

- не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

- для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

- вся используемая для приготовления реагентов посуда должна быть тщательно вымыта и сполоснута дистиллированной водой;

- необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

- запрещается возвращать избыток Кг-1, Кг-2, раствора ТМБ и стоп-реагента из ванночек во флаконы;

- из флаконов с открытыми крышками происходит испарение, которое может привести к получению некорректных результатов при повторном использовании реагентов. После окончания внесения реагентов в лунки планшета на каждой стадии анализа необходимо плотно закрывать крышки флаконов и помещать в рекомендуемые условия хранения;

- каждый образец сыворотки крови человека, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником.

- не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

- необходимо использовать пипетки полуавтоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

- во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

4.2  При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

4.3  При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение новой калибровочной кривой и рекомендуется определение концентрации IgE в контрольной сыворотке.

 

5  Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1  Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения ОП растворов в лунках планшета при длинах волн 405, 450 и 620 нм (референтная длина волны). Применение длины волны 620 нм не является обязательным, но предпочтительнее, поскольку позволяет обнаружить интерференцию пластика;

- термостатируемый шейкер, позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебаний (3-4) мм и частотой            (8-13) Гц ((400-800) об/мин) при температуре 37 °С

- холодильник бытовой, поддерживающий температуру (2-8) °С;

- полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

- пипетки одноканальные автоматические переменного объема со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,01 до 5,0 мл (от 10 до 5000 мкл);

- пипетки 8-ми канальные автоматические переменного объема со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,3 мл (до 300 мкл);

- мерный цилиндр вместимостью 1000 мл;

- ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

- пробирки одноразовые с пробками вместимостью 3 мл или флаконы стеклянные вместимостью (10-15) мл;

- штатив для пробирок;

- вата медицинская гигроскопическая;

- бумага фильтровальная;

- перчатки резиновые хирургические;

- раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;

- раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

- вода дистиллированная или деионизированная;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива жидких отходов.

 

6  Подготовка к проведению анализа

6.1  Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин, но не более 1 ч.

Внимание! Все образцы сывороток и реагенты перед проведением анализа тщательно перемешать!

6.2  Подготовка иммуносорбента

Вскрыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов иммуносорбента. Оставшиеся стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковывании иммуносорбента в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в закрывающийся пакет из полиэтиленовой пленки и герметично закрыть.

Стрипы иммуносорбента можно хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3  Подготовка растворов калибровочных проб и контрольной сыворотки

Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или пробкам. Открыть флаконы и положить пробки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5 мл (500 мкл) дистиллированной воды. Флаконы закрыть пробками, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая образования пены. В течение следующих 10 мин выдержать флаконы при температуре (18-25) °С, периодически перемешивая их содержимое.

Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.

Растворенные калибровочные пробы и контрольную сыворотку, а также вскрытые флаконы с жидкими калибровочными пробами и контрольной сывороткой можно хранить при температуре (2-8) °С не более 2 месяцев.

6.4  Приготовление раствора для промывания планшета

В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл внести содержимое флаконов с ФСБ-Т×20, затем добавить дистиллированной воды до метки 560 мл и аккуратно перемешать раствор, избегая образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×20 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимое количество ФСБ-Т×20 в мерный стакан или цилиндр и развести его дистиллированной водой в 20 раз.

Пример – В мерный цилиндр внести 5 мл ФСБ-Т×20 и 95 мл дистиллированной воды, перемешать раствор, избегая образования пены.

Раствор для промывания планшета можно хранить закрытым при температуре (2-8) °С не более 5 суток.

Неиспользованный ФСБ-Т×20 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5  Подготовка Кг-1, Кг-2 и раствора ТМБ

Кг-1, Кг-2, и раствор ТМБ готовы к использованию. Расход Кг-1 на один стрип (8 лунок) составляет 0,875 мл; расход Кг-2 на один стрип составляет 1,5 мл; расход раствора ТМБ на один стрип – 1,15 мл.

После вскрытия флаконов растворы можно хранить при температуре (2-8) °С не более 2 месяцев.

6.6  Подготовка стоп-реагента

Стоп-реагент готов к использованию. Расход стоп-реагента на один стрип составляет 1,15 мл.

После вскрытия флакона раствор можно хранить при температуре (2-8) °С в течение всего срока годности.

6.7  Подготовка растворов биотиниллированных аллергенов

Для восстановления лиофилизованных биотиниллированных аллергенов перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или пробкам. Открыть флаконы и положить пробки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 3,0 мл (3000 мкл) дистиллированной воды. Флаконы закрыть пробками, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая образования пены. В течение следующих 10 мин выдержать флаконы при температуре (18-25) °С, периодически перемешивая их содержимое.

Жидкие биотиниллированные аллергены готовы к использованию.

Восстановленные лиофилизированные биотиниллированные аллергены можно хранить плотно закрытыми при температуре (2-8) °С не более 2 месяцев либо при температуре минус 20 °С и ниже – до истечения срока годности. Допускается не более 4-х циклов замораживания-размораживания без потери связующей способности.

Вскрытые флаконы с жидкими биотиниллированными аллергенами можно хранить плотно закрытыми при температуре (2-8) °С до истечения срока годности.

7   Требования к промыванию планшета

7.1  Для промывания планшета рекомендуется использовать автоматический или полуавтоматический промыватель – вошер; в случае отсутствия вошера можно промывать лунки 8-канальной пипеткой;

- на всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

- необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок, встряхнуть планшет на шейкере в течение (5-10) с с последующим декантированием;

- при каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

- некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

 

8  Проведение анализа

8.1  Составить протокол маркирования лунок в соответствии с рисунком 2.

 

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

ТМБ

ТМБ

№1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

B

С0

С0

№2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C

С1

С1

№3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

D

С2

С2

№4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

E

С3

С3

№5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

F

С4

С4

№6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G

С5

С5

№7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H

КС

КС

№8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 2

Лунки маркировать следующим образом:

- А1, А2 — для измерения величины ОП раствора ТМБ;

- В1, В2 — для измерения величины ОП калибровочной пробы С0;

- С1, С2 — для измерения величины ОП калибровочной пробы С1;

- D1, D2 — для измерения величины ОП калибровочной пробы С2;

- E1, E2 — для измерения величины ОП калибровочной пробы С3;

- F1, F2 — для измерения величины ОП калибровочной пробы С4;

- G1, G2 — для измерения величины ОП калибровочной пробы С5;

- Н1, Н2 — для измерения величины ОП контрольной сыворотки (КС);

- А3,В3 - …. — для измерения величины ОП образцов исследуемых сывороток крови человека №1 - ….

8.2  Внести в дубликатах в соответствующие лунки стрипов иммуносорбента по 0,05 мл (50 мкл) калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки – в монопликатах по 0,05 мл (50 мкл) проб исследуемых образцов сыворотки крови.

Внимание! Количество лунок, заполняемых образцом каждой из исследуемых сывороток, определяется количеством аллергенов, на наличие специфических IgE к которым исследуется образец. При этом определение аллерген-специфических IgE производится из расчета 1 лунка для каждого аллергена.

8.3  Внести во все лунки стрипов иммуносорбента, содержащие калибровочные пробы и контрольную сыворотку, по 0,1 мл (100 мкл) Кг-1.

8.4  Внести во все лунки стрипов иммуносорбента, содержащие пробы исследуемых образцов сыворотки крови, по      0,1 мл (100 мкл) растворов требуемых аллергенов в соответствии с намеченной схемой.

Внимание! Общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и проб исследуемых образцов сыворотки крови не должно превышать 15 мин, а общее время нанесения аллергенов крови не должно превышать 10 мин, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным результатам!

8.5  Инкубировать планшет иммуносорбента на термостатируемом шейкере со скоростью (500-800) об/мин при температуре (37±1) °С в течение 1 ч либо в термостате при температуре (37±1) °С в течение 1 ч 30 мин.

8.5  Удалить содержимое лунок с помощью промывателя в контейнер с дезинфицирующим раствором, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.4) пять раз.

8.6  Внести во все лунки стрипов иммуносорбента, кроме лунок А1 и А2, по 0,15 мл (150 мкл) Кг-2.

8.7  Инкубировать планшет иммуносорбента на термостатируемом шейкере со скоростью (500-800) об/мин при температуре (37±1) °С в течение 30 мин либо в термостате при температуре (37±1) °С в течение 45 мин.

8.8  Удалить содержимое лунок с помощью промывателя в контейнер с дезинфицирующим раствором, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.4) пять раз.

8.9  Внести немедленно во все лунки по 0,1 мл (100 мкл) раствора ТМБ и инкубировать планшет иммуносорбента в защищенном от света месте на термостатируемом шейкере со скоростью (500-800) об/мин при температуре (37±1) °С в течение 15 мин.

8.10  Остановить реакцию путем внесения во все лунки планшета иммуносорбента с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 0,1мл (100 мкл) стоп-реагента. Планшет встряхнуть на шейкере в течение (1-2) мин.

8.11  Не позже чем через (15-20) мин после остановки реакции, определить ОП в лунках стрипов иммуносорбента в одноволновом режиме при длинах волн 405 нм и 450 нм или в двухволновом режиме при длинах волн 450 нм и 405 нм относительно 620 нм.

8.12  Схема анализа приведена в таблице 1.

 

Таблица 1 – Схема проведения анализа

 

Стадия анализа и реагенты

Номер лунки в соответствии с

протоколом маркировки лунок по п 8.1

А1, А2

В1, В2

С1, С2

D1, D2

E1, E2

F1, F2

G1, G2

Н1, Н2

А3-Н12

КП С0, мкл

50

КП С1, мкл

50

КП С2, мкл

50

КП С3, мкл

50

КП С4, мкл

50

КП С5, мкл

50

КС, мкл

50

СХ, мкл

50

Кг-1, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация №1

(37±1) °С, термостатируемый шейкер, 1 ч

либо (37±1) °С, термостат, 1 ч 30 мин

5-кратная промывка: промывочный буферный раствор, мкл

300

300

300

300

300

300

300

300

300

Кг-2, мкл

150

150

150

150

150

150

150

150

Инкубация №2

(37±1) °С, термостатируемый шейкер, 30 мин

либо (37±1) °С, термостат, 45 мин

5-кратная промывка: промывочный буферный раствор, мкл

300

300

300

300

300

300

300

300

300

Раствор ТМБ, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация №3

(37±1) °С, термостатируемый шейкер, 15 мин

место, защищенное от света

Стоп-реагент, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Перемешивание

(18-25)° С, шейкер, (1-2) мин

Измерение ОП растворов в лунках стрипов иммуносорбента, ОЕ

Спектрофотометр, 405 нм и 450 нм

Расчет результатов

Калькулятор и масштабная бумага

либо соответствующая компьютерная программа

Примечания

1  КП – калибровочная проба;

2  КС – контрольная сыворотка;

3  СХ – анализируемые пробы.

 

9  Обработка результатов анализа

9.1  Если программа фотометра позволяет вычитать среднее арифметическое значение ОП растворов в лунках А1 и А2 из значений ОП растворов всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В — среднее арифметическое значение ОП растворов в лунках, содержащих калибровочные или значение ОП растворов в лунках, содержащих исследуемые пробы образцов сыворотки крови, ОЕ.

Если программа фотометра не позволяет вычитать среднее арифметическое значение ОП растворов в лунках А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой    В–BТ, где ВТ — среднее арифметическое значение ОП растворов в лунках А1 и А2, ОЕ.

Примечание - Среднее арифметическое значение ОП растворов в лунках А1 и А2 не должно превышать 0,09 ОЕ.

9.2  Рассчитать величину В, ОЕ, для каждой пары лунок, содержащих калибровочные пробы С05, контрольную сыворотку, и для лунок, содержащих пробы исследуемых образцов сыворотки крови, измеренных при длине волны 405 нм.

9.3  Рассчитать величину В, ОЕ, для каждой пары лунок, содержащих калибровочные пробы С04, контрольную сыворотку, и для лунок, содержащих пробы исследуемых образцов сыворотки крови, измеренных при длине волны 450 нм.

9.4  В линейных координатах построить для калибровочных проб С04 калибровочный график № 1 зависимости величины В, ОЕ, от концентрации IgE в калибровочных пробах С04, МЕ/мл, измеренных при длине волны 450 нм, откладывая на оси ординат значения ОП, ОЕ, а по оси абсцисс – значения концентраций IgE, МЕ/мл, в соответствующих калибровочных пробах (Рис. 3).

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3. Типичный калибровочный график № 1

 

Внимание! Запрещается использовать графики для оценки реальных экспериментальных данных!

9.5  В линейных координатах построить для калибровочных проб С05 калибровочный график № 2 зависимости величины В, ОЕ, от концентрации IgE в калибровочных пробах С05, МЕ/мл, измеренных при длине волны 405 нм, откладывая на оси ординат значения ОП, ОЕ, а по оси абсцисс – значения концентраций IgE, МЕ/мл, в соответствующих калибровочных пробах (Рис. 4).

 

 

 

 

Рисунок 4. Типичный калибровочный график № 2

 

 

Внимание! Запрещается использовать для оценки реальных экспериментальных данных!

9.6  Определение концентрации аналита в контрольной сыворотке и пробах исследуемых образцов сыворотки крови человека производить следующим образом:

- в случае, если значение ОП, ОЕ, измеренное при длине волны 450 нм, составляет менее 2,3 ОЕ, то для вычислений следует использовать калибровочный график № 1;

- в случае, если значение ОП, ОЕ, измеренное при длине волны 450 нм, больше 2,3 ОЕ, то для вычислений следует использовать калибровочный график № 2;

 

9.7  Критерии достоверности анализа

Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих условий:

- значения ОП растворов после остановки ферментной реакции в лунках, содержащих калибровочные пробы С0 – С5 и раствор ТМБ, ОЕ, должны находиться в интервале значений, указанных в таблице 2.

 

 

 

 

 

 

Таблица 2

 

Наименование образца

Длина волны

Допустимый интервал

значений ОП, ОЕ

Раствор ТМБ

450 нм

≤ 0,090

Калибровочная проба С0

450 нм

≤ 0,03

Калибровочная проба С1

450 нм

0,079 — 0,209

Калибровочная проба С2

450 нм

0,165 — 0,378

Калибровочная проба С3

450 нм

0,615 — 1,665

Калибровочная проба С4

450 нм

≥ 2,300

Калибровочная проба С5

405 нм

≥ 1,018

 

- концентрация контрольной сыворотки находиться в диапазоне, указанном на этикетке флакона, МЕ/мл.

Если полученные данные выходят за пределы указанных значений, результаты анализа считают недостоверными и анализ повторяют.

 

9.8  Интерпретация результатов

Для клинических целей концентрации специфических IgE оценивают, используя таблицу 3.

 

Таблица 3

 

Концентрация IgE, МЕ/мл

Класс

Уровень специфического IgE

≤ 0,35

0

Клинически не значимый

0,36 — 0,50

0 — 1

Очень низкий

0,51 — 1,00

1

Низкий

1,10 — 5,00

2

Средний

5,10 — 25,00

3

Высокий

25,10 — 75,00

4

Очень высокий

> 75,00

5

Исключительно высокий

 

9.9  Ограничения по использованию набора

Отрицательный результат анализа на определение специфических IgE к антибиотикам пенициллина G, пенициллина V, цефалоспорина, ампициллина и амоксициллина не исключает наличия клинической гиперчувствительности к данным аллергенам. Такой ответ может объясняться тем, что возникновение аллергической реакции происходит без участия IgE-антител, или неправильным выбором срока отбора образцов крови (до появления специфических IgE в циркуляции или после падения их концентрации).

Отрицательный результат анализа на определение специфических IgE к пищевым аллергенам и к ядам насекомых не исключает возможности последующего развития клинической гиперчувствительности по отношению к этим аллергенам.

В случаях, когда содержание общего IgE в сыворотке крови превышает 1000 МЕ/мл, измеряемые концентрации специфических IgE могут быть несколько ниже реальных значений.

Следует помнить, что IgE, специфичные к конкретному аллергену, могут связывать другие схожие по структуре аллергены (например, пыльца березы и орехи, луговые травы и томат, амброзия и дыня, и т.д.). Это обусловлено наличием общих антигенных детерминант в аллергенах различного происхождения. При постановке диагноза эти обстоятельства должны приниматься во внимание.

 

10  Аналитические характеристики набора

10.1  Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции моноклональных антител к IgE с IgA, IgG, IgM и IgD.

10.2  Коэффициент вариации результатов определения специфических IgE в одном и том же образце сыворотки крови с использованием набора «ИФА-Аллерго IgE» не превышает 8 %.

10.3  Линейность. Зависимость концентрации специфических IgE в образцах сыворотки крови при разведении их калибровочной пробой С0, имеет линейный характер в диапазоне концентраций калибровочных проб С15, МЕ/мл и составляет          ± 10%.

10.4  Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» IgE – отношение измеренной к расчетной концентрации IgE в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы С2. Процент открытия составляет (90–110) %.

10.5  Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация IgE в сыворотке крови человека не превышает 0,15 МЕ/мл.

 

11  Форма выпуска набора

11.1  Набор выпускается в двух вариантах комплектации:

комплект 1 – для проведения анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение анализа в монопликатах          80 неизвестных проб и в дубликатах 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для измерения значения ОП раствора ТМБ. Набор рассчитан на 4 постановки ИФА: 1 постановка – 3 стрипа (24 лунки). Всего – 96 определений;

комплект 2 – для проведения анализа на автоматическом анализаторе открытого типа. Набор рассчитан на проведение анализа в монопликатах 88 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для измерения значения ОП раствора ТМБ. Набор рассчитан на 6 постановок иммуноферментного анализа: 1 постановка –               2 стрипа (16 лунок). Всего – 96 определений.

Один флакон биотинилированного аллергена рассчитан на проведение анализа в монопликатах 26 проб образцов сыворотки крови человека.

 

12  Условия хранения и применения набора

12.1  Хранение набора должно производиться в упаковке предприятия-изготовителя в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре (2-8) °С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 15 суток.

Запрещается замораживать компоненты набора.

12.2  Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

12.3  Срок годности набора – 18 месяцев.

12.4  Срок годности биотинилированных аллергенов – 18 месяцев.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение А

(справочное)

 

А.1 Биотилинированные аллергены, выпускаемые СП ООО «Фармлэнд», указанны в таблице А.1.

 

Таблица А.1 – Перечень биотинилированных аллергенов

 

Группа

Наименование

группы

Код

биотинилированного

аллергена

Наименование

биотинилированного аллергена

С

Лекарственные вещества

с1

Пенициллин G

с2

Пенициллин V

с70

Инсулин свиньи

с71

Бычий инсулин

с73

Инсулин человека

с201

Цефалоспорин С

с202

Сукцинилхолин

с203

Ампициллин

с204

Амоксициллин

с206

Адренокортикотропный гормон (АКТГ)

D

Клещевые

аллергены

d1

Dermatophagoides pteronyssinus

d2

Dermatophagoides farinae

d3

Dermatophagoides microceras

d70

Acarus siro

d71

Lepidogliphus destructor

d72

Tyrophagus putrescentiae

d73

Glyciphagus domesticus

d74

Eurogliphus maynei

E

Эпидермальные и белки животного происхождения

е1

Эпителий кошки

е2

Эпителий собаки

е3

Перхоть лошади

е4

Перхоть коровы

е5

Перхоть собаки

е6

Эпителий морской свинки

е7

Помет голубя

е70

Гусиные перья

е71

Эпителий мыши

е72

Белки мочи мыши

е73

Эпителий крысы

е74

Белки мочи крысы

е75

Белки сыворотки крысы

е76

Белки сыворотки мыши

е77

Помет волнистого попугайчика

е78

Перья волнистого попугайчика

е79

Сыворотка крови волнистого попугайчика

е80

Эпителий козы

е81

Эпителий и шерсть овцы

е82

Эпителий кролика

е83

Эпителий свиньи

е84

Эпителий хомяка

е85

Куриные перья

е86

Утиные перья

F

Пищевые

аллергены

f1

Яичный белок

f2

Молоко коровье

f3

Треска (Gadus morhua)

f4

Пшеница (Triticum aestivum)

f5

Рожь

f6

Ячмень

f7

Овес (Avena sativa)

f8

Маис (кукуруза)

f9

Рис (Oryza sativa)

Группа

Наименование

группы

Код

биотинилированного

аллергена

Наименование

биотинилированного аллергена

F

Пищевые

аллергены

f10

Кунжут

f11

Греча (Fagopyrum esculentum)

f12

Горох

f13

Арахис (Arachis hypogaea)

f14

Соевые бобы (Glycine max)

f15

Белая фасоль

f17

Лесной орех, фундук

f18

Бразильский орех

f20

Миндаль

f23

Крабовое мясо

f24

Креветки

f25

Томат

f26

Свинина (Sus spp.)

f27

Говядина (Boss spp.)

f31

Морковь

f33

Апельсин (Citrus sinensis)

f35

Картофель (Solanum tuberosum)

f36

Кокос

f37

Мидии

f40

Тунец

f41

Лосось, семга

f44

Клубника, земляника

f45

Пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae)

f47

Чеснок

f48

Лук

f49

Яблоко (Malus sylvestris)

f53

Персик

f59

Осьминог

f61

Сардина

f75

Яичный желток

f76

α-лактальбумин

f77

β-лактоглобулин

f78

Казеин

f79

Глютен

f80

Омар

f81

Сыр типа Чеддер

f82

Сыр с плесенью

f83

Куриное мясо (Gallus spp.)

f84

Киви

f85

Сельдерей

f86

Петрушка

f87

Дыня

f88

Баранина

f89

Горчица

f90

Солод

f91

Манго

f92

Банан (Musa spp.)

f94

Груша

f96

Авакадо

f97

Какао

f129

Сладкий перец (овощ)

f131

Артишок

f202

Кешью

f203

Фисташки

f204

Форель

f205

Сельдь

f206

Скумбрия

f207

Морской моллюск

Группа

Наименование

группы

Код

биотинилированного

аллергена

Наименование

биотинилированного аллергена

F

Пищевые

аллергены

f208

Лимон

f210

Ананас

f212

Грибы

f213

Мясо кролика

f214

Шпинат

f215

Салат-латук

f216

Капуста белокачанная

f217

Брюссельская капуста

f218

Красный перец (специя)

f221

Кофе

f242

Вишня

f246

Гуаровая смола

f253

Кедровый орех (pine seed)

f225

Тыква

f232

Овальбумин

f233

Овомукоид

f234

Ваниль

f235

Чечевица

f237

Абрикос

f239

Арбуз

f244

Огурец

f254

Камбала

f255

Слива

f256

Грецкий орех

f258

Кальмар

f259

Виноград

f261

Спаржа

f262

Баклажан

f263

Зеленый перец (специя)

f269

Базилик

f276

Фенхель

f280

Черный перец

f283

Орегано

f284

Индейка

f287

Красная фасоль

f291

Цветная капуста

f297

Гуммиарабик

f299

Конский каштан

f302

Мандарин

f309

Горох турецкий

f314

Улитка

f321

Мясо лошади

G

Луговые

травы

g1

Колосок душистый (Anthoxanthum odoratum)

g2

Свинорой пальчатый (Бермудская трава) (Cynodon dactylon)

g3

Ежа сборная (Dactylis glomerata)

g4

Овсяница луговая (Festuca elatior)

g5

Плевел (Lolium perenne)

g6

Тимофеевка луговая (Phleum pratense)

g7

Тростник обыкновенный (Phragmites communis)

g8

Мятлик луговой (Poa pratensis)

g9

Полевица (Agrostis stolonifera)

g10

Сорго (Sorghum halepense)

g11

Костер полевой (Bromus inermis)

g12

Рожь посевная (Secale cereale)

g13

Бухарник шерстистый (Holcus lanatus)

g14

Овес культивированный (Avena sativa)

g15

Пшеница культивированная (Triticum sativum)

Группа

Наименование

группы

Код

биотинилированного

аллергена

Наименование

биотинилированного аллергена

G

Луговые

травы

g16

Лисохвост луговой (Alopecurus pratensis)

g17

Гречка заметная (Paspalum notatum)

g70

Колосняк (Elymus triticoides)

g71

Канареечник (Phalaris arumdinacea)

H

Аллергены

домашней пыли

h1

Пыль домашняя (Greer Labs. Inc.)

h2

Пыль домашняя (Hollister-Stier Labs.)

I

Яды

насекомых

i1

Пчела (Apis mellifera)

i2

Шершень (Dolicholicovespula maculata)

i3

Оса (Vespula species)

i4

Полист (Polistes species)

i5

Желтый шершень (Dolicholicovespula arenaria)

i6

Таракан-прусак (Blatella germanica)

i70

Рыжий муравей (Solenopsis invicta)

i71

Москит (комар) (Aedes communis)

i75

Европейский шершень (Vespa crabro)

i204

Слепень (Tabanus spp.)

K

Профессиональные

аллергены

k16

Семя льна

k70

Зеленый кофе

k74

Шелк

k75

Изоцианат TDI

k76

Изоцианат МDI

k77

Изоцианат НDI

k78

Оксид этилена

k79

Фталевый альдегид

k82

Латекс

k83

Семя хлопчатника

k85

Хлорамин Т

k86

Тримеллитовый ангидрид (Trimellitic anhydride)

k87

Альфа-амилаза

k201

Папаин

k202

Бромелайн/бромелин

M

Плесневые и

дрожжевые

грибы

m1

Penicillium notatum

m2

Cladosporium herbarum

m3

Aspergillus fumigates

m4

Mucor rasemosus

m5

Candida albicans

m6

Alternaria alternate (tenius)

m7

Botrytis cinerea

m8

Helmintosporium halodes

m9

Fusarium moniliforme

m10

Stemphylium botrysum

m11

Rhizopus nigricans

m12

Areobasidium pullulans

m13

Phoma betae

m14

Epicoccum purpurascens

m15

Tricoderma viridae

m16

Curvularia lunata

m17

Aspergillus amstelodami

m28

Penicillium exspansum

m33

Aspergillus niger

m51

Aspergillus nidulans

m59

Penicillium digitatum

m205

Trichohyton rubrum

P

Паразитарные

аллергены

p1

Аскарида (Ascaris lumbricoides)

p4

Anisakis simplex

Т

Пыльца

деревьев

t1

Клен ясенелистный (Acer negundo)

t2

Ольха серая (Alnus incana)

t3

Береза бородавчатая (Betula verrucosa)

Группа

Наименование

группы

Код

биотинилированного

аллергена

Наименование

биотинилированного аллергена

Т

Пыльца

деревьев

t4

Орешник, лещина (Corylus avellana)

t5

Американский бук (Fagus grandifolia)

t6

Горный можжевельник (Juniperus sabinoides)

t7

Дуб (Quercus alba)

t8

Ильм (Вяз) (Ulmus americana)

t9

Маслина европейская (Olea europea)

t10

Грецкий орех (американская разновидность) (Juglas californica)

t11

Платан (Platanus acerifolia)

t12

Ива (Salix caprea)

t14

Тополь трехгранный (Populus deltoides)

t15

Американский ясень (Fraxinus americana)

t16

Сосна (Pinus strobus)

t17

Криптомерия (Cryptomeria japonica)

t18

Эвкалипт (Eucaliptus spp.)

t19

Акация (Acacia longifolia)

t20

Мескитовое дерево (Prosopis juliflora)

t21

Каепутовое дерево (Melaleuca leucadendron)

t22

Гикори (Carya pecan)

t23

Средиземноморский кипарис (Cupressus sempervirens)

t31

Аризонский кипарис (Cupressus arizonica)

t70

Тутовник белый (Morus alba)

t203

Конский каштан (Aesculus hyppocastanus)

t205

Бузина черная (Sambucus nigra)

t206

Благородный каштан (Castanea sativa)

t208

Липа (Tilia cordana)

t210

Бирючина обыкновенная (Ligustrum vulgare)

t214

Финик пальчатый (Phoenix dactilifera)

W

Сорные

травы

w1

Амброзия обыкновенная (Ambrosia elatior)

w2

Амброзия западная (Ambrosia psylostachya)

w3

Амброзия гигантская (Ambrosia trifida)

w4

Амброзия ложная (Ambrosia acanthicarpa)

w5

Полынь горькая (Artemisia absinthium)

w6

Полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris)

w7

Нивяник (Chrysanthemum leucanthemum)

w8

Одуванчик (Taraxacum vulgare)

w9

Подорожник (Plantago lanceolata)

w10

Марь белая (Chenopodium album)

w11

Поташник (Salsola kali)

w12

Золотарник (Solidago virgaurea)

w13

Дурнишник (Xanthium commune)

w14

Амарант, подсвекольник (Amaranthus retroflexus)

w15

Лебеда (Atriplex lentiformis)

w16

Бузина болотная (Iva ciliata)

w17

Кохиа (болотный кипарис) (Kochia scoparia)

w18

Щавель (Rumex acetosella)

w19

Постенница лекарственная (Parietaria officinalis)

w20

Крапива двудомная (Urtica dioica)

w21

Постенница (Parietaria judaica)

w204

Подсолнечник (Helianthus annuus)

w206

Ромашка (Camomil)

w210

Свекла обыкновенная (Beta vulgaris)

 

Смеси

аллергенов

gm1

Смесь луговых трав (g3-g4-g5-g6-g8) (ежа сборная + овсяница луговая + райграс многолетний + тимофеевка луговая + мятлик луговой)

gm2

Смесь трав (g2-g7-g10-g12-g13-g17) (свинорой пальчатый (бермудская трава) + тростник обыкновенный + сорго + рожь посевная + бухарник шерстистый + гречка заметная)

Группа

Наименование

группы

Код

биотинилированного

аллергена

Наименование

биотинилированного аллергена

 

Смеси

аллергенов

wm1

Смесь сорных трав (w1-w6-w7-w9-w10-w19) (амброзия обыкновенная + полынь обыкновенная + нивяник, поповник + марь белая + постенница лекарственная)

wm2

Смесь сорных трав (w1-w6-w7-w8-w9) (амброзия обыкновенная + полынь обыкновенная + нивяник + одуванчик + подорожник)

mm1

Смесь плесневых аллергенов (m1-m2-m3-m4-m6) (Penicillium notatum + Cladosporium herbarum + Aspergillus fumigatеs + Mucor rasemosus + Alternaria alternate (tenius))

tm1

Смесь древесных аллергенов (t2-t5-t7-t8-t9-t11) (ольха серая + американский бук + дуб + вяз + маслина европейская + платан)

tm2

Смесь аллергенов деревьев (раннее цветение: t2-t3-t4-t15) (раннее цветение: ольха серая + береза бородавчатая + орешник, лещина + американский ясень)

tm3

Смесь аллергенов деревьев (позднее цветение: t1-t5-t7-t12-t14) (позднее цветение: клен ясенелистный + американский бук + дуб + ива + тополь трехгранный)

dm1

Смесь бытовых аллергенов (d1-d2-e1-e2) (Dermatophagoides pteronyssinus + Dermatophagoides farinae + эпителий кошки + эпителий собаки)

fm1

Смесь аллергенов детского питания (f1-f2-f3-f4-f14-f25-f75) (яичный белок + молоко + рыба (треска) + пшеница + соевые бобы + томат + яичный желток)

fm2

Смесь аллергенов рыбы (f3-f23-f24-f80) (рыба (треска) + крабовое мясо + креветки + мидии)

fm3

Смесь аллергенов злаковых (f4-f6-f7-f8-f9) (пшеница + ячмень + овес + маис (кукуруза) + рис)

fm4

Смесь аллергенов рыбы (f3-f41-f205-f206-f254) (рыба (треска) + тунец + лосось, семга + сельдь + скумбрия + камбала)

fm6

Смесь аллергенов орехов (f11-f18-f20-f36-f256) (греча + бразильский орех + миндаль + кокос + грецкий орех)

fm7

Смесь аллергенов овощей (f12-f25-f31-f35-f85) (горох + томаты + морковь, картофель + сельдерей)

fm8

Смесь аллергенов овощей (f15-f47-f48-f215-f216) (белая фасоль + чеснок + лук, салат-латук + капуста белокачанная)

fm11

Смесь аллергенов злаковых (f4-f6-f7-f8-f9-f11) (пшеница + ячмень + овес + маис (кукуруза) + рис + греча)

em1

Смесь перьевых аллергенов (е70-е85-е86) (гусиные перья+ куриные перья + утиные перья)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение Б

(справочное)

 

Библиография

 

 

 

[1]

 

Санитарные правила

СП 17-129 РБ 2000 «Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности и гельминтами», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 27.07.2000 г. № 40

[2]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 16.12.1998 г. № 351

О пересмотре ведомственных нормативных актов, регламентирующих вопросы по проблеме ВИЧ/СПИД

[3]

 

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 25.11.2002 г. № 165

О проведении дезинфекции и стерилизации учреждениями здравоохранения

[4]

 

Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 28.04.2010 г. № 47

Об утверждении Инструкции о порядке проведения обязательных медицинских осмотров работающих и признании утратившими силу некоторых постановлений Министерства здравоохранения Республики Беларусь

[5]

 

Санитарные нормы и правила

СанПиН № 2.1.7.14-20-2005 «Правила обращения с медицинскими отходами»

 

 

 

 

 

 

Изготовитель  СП ООО «Фармлэнд»  Почтовый адрес: 220113 г. Минск, ул. Восточная, 129. Тел\факс (017) 2621417.

По вопросам применения и качества набора обращаться на предприятие-изготовитель СП ООО «Фармлэнд».